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新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南（新型冠状病毒肺炎防控方案（第七版）的附件6）

发布时间：2021/04/18 新冠核酸检测 浏览次数：349 欢迎阅读！

为指导各级疾控部门和其他相关机构开展新型冠状病毒肺炎病例标本采集与实验室检测工作，特制定本技术指南。

一、标本采集

（一）采集对象。

新型冠状病毒肺炎疑似病例和聚集性病例，需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者，或其他需要进一步筛查检测的环境或生物材料。

（二）标本采集要求。

1. 从事新型冠状病毒检测标本采集的技术人员应当经过生物安全培训（培训合格）和具备相应的实验技能。

2. 住院病例的标本由所在医院的医护人员采集。

3. 密切接触者标本由当地指定的疾控机构、医疗机构负责采集。

4. 根据实验室检测工作的需要，可结合病程多次采样。

（三）采集标本种类。

每个病例必须采集急性期呼吸道标本（包括上呼吸道标本或下呼吸道标本），重症病例优先采集下呼吸道标本；根据临床需要可留取便标本、全血标本、血清标本和尿标本。

标本种类：

1. 上呼吸道标本：包括鼻咽拭子、咽拭子等。

2. 下呼吸道标本：深咳痰液、肺泡灌洗液、支气管灌洗液、呼吸道吸取物等。

3. 便标本/肛拭子：留取粪便标本约10克（花生大小），如果不便于留取便标本，可采集肛拭子。

4. 血液标本：尽量釆集发病后7天内的急性期抗凝血，采集量5ml，建议使用含有EDTA抗凝剂的真空釆血管采集血液。

5. 血清标本：尽量釆集急性期、恢复期双份血清。第一份血清应当尽早（最好在发病后7天内）釆集，第二份血清应当在发病后第3～4周釆集。采集量5ml，建议使用无抗凝剂的真空釆血管。血清标本主要用于抗体的测定，不进行核酸检测。

6. 尿标本：留取中段晨尿，采集量2～3ml。

（四）标本采集和处理。

1. 鼻咽拭子：采样人员一手轻扶被采集人员的头部，一手执拭子，拭子贴鼻孔进入，沿下鼻道的底部向后缓缓深入，由于鼻道呈弧形，不可用力过猛，以免发生外伤出血。待拭子顶端到达鼻咽腔后壁时，轻轻旋转一周（如遇反射性咳嗽，应停留片刻），然后缓缓取出拭子，将拭子头浸入含2～3ml 病毒保存液（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液）的管中，尾部弃去，旋紧管盖。

2. 咽拭子：被采集人员先用生理盐水漱口，采样人员将拭子放入无菌生理盐水中湿润（禁止将拭子放入病毒保存液中，避免抗生素引起过敏），被采集人员头部微仰，嘴张大，并发“啊”音，露出两侧咽扁桃体，将拭子越过舌根，在被采集者两侧咽扁桃体稍微用力来回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次，将拭子头浸入含2～3ml病毒保存液（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液）的管中，尾部弃去，旋紧管盖。咽拭子也可与鼻咽拭子放置于同一管中。

3. 鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采样液冲洗收集器1次（亦可用小儿导尿管接在50ml注射器上来替代收集器）。

4. 深咳痰液：要求病人深咳后，将咳出的痰液收集于含3ml采样液的采样管中。如果痰液未收集于采样液中，可在检测前，加入2～3ml采样液，或加入痰液等体积的痰液消化液。痰液消化液储存液配方见表1。

表1 痰液消化液储存液配方

使用时将储存液用去离子水稀释至50 ml，与痰液等体积混合使用，或者参照试剂说明进行使用，也可采用痰液等体积的含1g/L蛋白酶K的磷酸盐缓冲液将痰液化。

5. 支气管灌洗液：将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管（约30cm深处），注入5ml生理盐水，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的粘液，并用采样液冲洗收集器1次，也可用小儿导尿管接在50ml注射器上来替代收集。

6. 肺泡灌洗液：局部麻醉后将纤维支气管镜通过口或鼻经过咽部插入右肺中叶或左肺舌段的支气管，将其顶端契入支气管分支开口，经气管活检孔缓缓加入灭菌生理盐水，每次30～50 ml，总量100～250ml，不应超过300ml。

7. 粪便标本：取1ml标本处理液，挑取黄豆粒大小的便标本加至管中，轻轻吹吸3～5次，室温静置10分钟，以8000 rpm 离心5分钟，吸取上清液进行检测。粪便标本处理液可自行配制，配方见表2。

表2 粪便标本处理液配方

也可使用HANK’S液或其它等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液溶解便标本制备便悬液。如患者出现腹泻症状，则留取粪便标本3～5ml，轻轻吹打混匀后，以8000 rpm 离心5分钟，吸取上清液备用。

8. 肛拭子：用消毒棉拭子轻轻插入肛门3～5cm，再轻轻旋转拔出，立即放入含有3～5ml病毒保存液的15ml外螺旋盖采样管中，弃去尾部，旋紧管盖。

9. 血液标本：建议使用含有EDTA抗凝剂的真空采血管采集血液标本5ml，根据所选用核酸提取试剂的类型确定以全血或血浆进行核酸提取。如需分离血浆，将全血1500～ 2000rpm离心10分钟，收集上清于无菌螺口塑料管中。

10. 血清标本：用真空负压采血管采集血液标本5ml，室温静置30分钟，1500～2000rpm离心10分钟，收集血清于无菌螺口塑料管中。

11. 其他材料：依据设计需求规范采集。

（五）标本包装。

标本采集后在生物安全二级实验室生物安全柜内分装。

1. 所有标本应当放在大小适合的带螺旋盖内有垫圈、耐冷冻的样本采集管里，拧紧。容器外注明样本编号、种类、姓名及采样日期。

2. 将密闭后的标本装入密封袋，每袋限一份标本。样本包装要求要符合《危险品航空安全运输技术细则》相应的标准。

3. 涉及外部标本运输的，应2根据标本类型，按照A类或B类感染性物质进行三层包装。

（六）标本保存。

用于病毒分离和核酸检测的标本应当尽快进行检测，可在24小时内检测的标本可置于4℃保存；24小时内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存（如无-70℃保存条件，则于-20℃冰箱暂存）。血清标本可在4℃存放3天，-20℃以下可长期保存。应当设立专库或专柜单独保存标本。

（七）标本送检。

标本采集后应当尽快送往实验室，如果需要长途运输，建议采用干冰等制冷方式进行保藏。标本运送期间应当避免反复冻融。

1. 上送标本。

各省（自治区、直辖市）5例及以上的聚集性病例，以及境外输入病例的所有原始标本上送中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所进行检测复核，并附样本送检单（见附表）。

2. 标本及毒株运输。

2.1 国内运输。

新型冠状病毒毒株或其他潜在感染性生物材料的运输包装分类属于A类，对应的联合国编号为UN2814，包装符合国际民航组织文件Doc9284《危险品航空安全运输技术细则》的PI602分类包装要求；环境样本属于B类，对应的联合国编号为UN3373，包装符合国际民航组织文件Doc9284《危险品航空安全运输技术细则》的PI650分类包装要求；通过其他交通工具运输的可参照以上标准包装。

新型冠状病毒毒株或其他潜在感染性材料运输应按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（原卫生部令第45号）办理《准运证书》。

2.2 国际运输。

在国际间运输的新型冠状病毒标本或毒株，应当规范包装，按照《出入境特殊物品卫生检疫管理规定》办理相关手续，并满足相关国家和国际相关要求。

2.3 标本和毒株管理。

新型冠状病毒标本及毒株应由专人管理，准确记录毒株和样本的来源、种类、数量，编号登记，采取有效措施确保毒株和样本的安全，严防发生误用、恶意使用、被盗、被抢、丢失、泄露等事件。

二、新型冠状病毒的实验室检测

（一）实时荧光RT-PCR方法检测新型冠状病毒核酸。

1. 新型冠状病毒核酸检测。

本指南中的核酸检测方法主要针对新型冠状病毒基因组中开放读码框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核壳蛋白（nucleocapsid protein，N）。

靶标一（ORF1ab）:

正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA

反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA

荧光探针（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'

靶标二（N）:

正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

荧光探针（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'

核酸提取和实时荧光RT-PCR反应体系及反应条件参考相关厂家试剂盒说明。

2. 结果判断。

阴性:无Ct值或Ct为40。

阳性：Ct值<37，可报告为阳性。

灰区：Ct值在37-40之间，建议重复实验，若重做结果Ct 值<40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性,否则为阴性。

注：如使用商品化试剂盒，则以厂家提供的说明书为准。

3. 病例确认。

实验室确认阳性病例需满足以下两个条件中的一个：

（1）同一份标本中新型冠状病毒2个靶标（ORF1ab、N）实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。如果出现单个靶标阳性的检测结果，则需要重新采样，重新检测。如果仍然为单靶标阳性，判定为阳性。

（2）两种标本实时荧光RT-PCR同时出现单靶标阳性，或同种类型标本两次采样检测中均出现单个靶标阳性的检测结果，可判定为阳性。

核酸检测结果阴性不能排除新型冠状病毒感染，需要排除可能产生假阴性的因素，包括：样本质量差，比如口咽等部位的呼吸道样本；样本收集的过早或过晚；没有正确的保存、运输和处理样本；技术本身存在的原因，如病毒变异、PCR抑制等。

（二）血清抗体检测。

血清抗体检测（胶体金、磁微粒化学发光、ELISA）用作新型冠状病毒核酸检测阴性病例的补充检测，在疑似病例诊断中与核酸检测协同使用。实验室确认阳性病例需满足血清新型冠状病毒特异性IgG抗体阳性或恢复期较急性期4倍及以上升高。

三、实验室活动生物安全要求

根据新型冠状病毒传播特性、致病性和临床资料等信息，该病毒按照第二类病原微生物进行管理，具体要求如下：

（一）实验活动规范。新型冠状病毒培养、动物感染实验应当在生物安全三级及以上实验室开展；未经培养的感染性材料的操作应当在生物安全二级及以上实验室进行，同时采用不低于生物安全三级实验室的个人防护；灭活材料的操作应当在生物安全二级及以上实验室进行；不涉及感染性材料的操作，可以在生物安全一级实验室进行。

（二）相关样本处置。各省级卫生健康行政部门要根据

疫情防控需要和实验室生物安全有关要求，及时研判提出新型冠状病毒实验室检测生物样本处置意见。对确需保存的，应当尽快指定具备保存条件的机构按照相对集中原则进行保存，或送至国家级菌（毒）种保藏中心保藏；对无需保存的，由相关机构按照生物安全有关要求及时处理。

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