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“新冠病毒核酸检测”，做不好这几点一切白费
全球疫情蔓延，国内疫情得到有效控制，目前我国已经进入了疫情的防守期。新冠病毒核酸检测是新冠肺炎确诊的金标准，但“核酸”阴性不等于没事，核酸阳性也可能是假阳性，所以不要过度神话核酸检测的结果，如何正确应用核酸检测结果，必须注意以下几点。
01
新冠病毒规范采样
新冠病毒样本采集：咽拭子规范操作
02
假阴性分析
有些确诊病例，核酸检测结果多次为阴性，主要原因归纳为：
（1）病毒入侵人体初期，人体内病毒量尚未达到可检测的程度。采样时机和采样部位的不同，可能导致所采集的标本中没有足够量的病毒；
（2）任何检测试剂都有其检测下限（即敏感性），如果患者标本内的病毒达不到所使用试剂的检测下限，则会出现假阴性；
（3）实验室仪器设备性能和人员检测能力差、质量管理落实不到位等也会产生“假阴性”；
（4）采样不规范、采集部位不当、采集标本不典型，导致标本中被病毒感染的细胞太少或没有。即可能造成“假阴性”。可见规范采集的重要性。
（5）靶基因的降解 ：
一般情况下， DNA 样本稳定性较好，在室温下放置 8h 仍不影响检验，新型冠状病毒为RNA病毒，靶基因降解对于 RNA 样品影响更为严重，由于环境中大量 RNA 酶的存在，若样品保存、运输条件不佳或存放时间过长，模板 RNA 非常容易降解，造成假阴性。
（6）PCR 抑制物：
反转录反应和 PCR 反应均为酶促反应，任何可能抑制这些反应的物质都会影响检验的结果。
02
假阳性因素分析
1、外源核酸污染 ：
由于 PCR 的灵敏度非常高，理论上一个核酸分子的污染都有可能引起结果的假阳性，因此 PCR 标本采集最好使用无菌、无核酶的一次性器材，取材必须严格执行无菌操作，并小心防止混入操作者或受检者的毛发、皮屑等。密封运输和保存，不能在扩增区域进行标本的采集和处理，防止 PCR 产物的污染。
只要有少的扩增产物将标本或反应管污染即可出现假阳性, PCR仪器的性能差异和温控不准等质量问题造成非特异性扩增也会导致假阳性现象。
如果样本采集和PCR试剂配制及反应实验过程中, 引物设计不合理, 选择的扩增列序与非目的性扩增列序具有同源性, 检测样品出现交叉污染、PCR试剂污染或PCR扩增产物污染、气溶胶污染以及实验室中克隆质粒污染都会造成假阳性现象出现。
PCR 检测体系含有阳性内对照（内标），该内对照使用的是内源性对照，通过检测内标是否正常来监测待测样本采样、提取过程以及样本中是否有核酸抑制物，避免 PCR 假阴性。
03
不合格样本影响检验结果
当采样时若标本没有采集到位或采集量极少，在进行分子检测中就没有内标，无法报告定性结果。
在新冠病毒核酸检测中，不合格样本通常是由于采样问题和采样用具问题导致的。
「有时候采集的咽拭子或鼻拭子中粘液成分过多，也会对 RT-PCR 结果造成影响，会报为不合格样本重新采样。」
在临床中另一个比较常见的情况就是送检样本盖子没盖严或有泄漏。这种情况下既会存在生物安全风险，同时发生泄漏后标本可能会受到污染或含量变少不够检测，在这种情况下也会报告不合格样本。
影响因素归纳为以下几点：
| 影响因素 | 具体原因分析 | 占比 | 对应方法 |
| 标本采集 | 标本采集、采样试剂问题 | 30% |
1、鼻拭子/咽拭子标本：患者发病3日内，可采集鼻拭子/咽拭子标本。 2粪便标本:如果患者发病早期出现腹泻症状，则留取粪便标本。 |
| 标本质量问题 |
1、鼻拭子标本：用无菌植绒拭子采样，将拭子贴鼻孔壁慢慢转动进入病人的一鼻孔内，至鼻腭处，然后边擦边旋转慢慢取出，以同一拭子擦拭另一鼻孔。 2、咽拭子标本：用无菌植绒 拭子采样，湿度用力拭抹咽喉壁部位，应避免触及舌部。 3、痰液标本：采样杯中装入2ml生理盐水，手机深部痰液或抽吸痰于一次性无菌旋盖样本杯中，采样杯中装入2ml生理盐水 4、肺泡灌洗液：有临床医生无菌操作下吸取10ml-20ml BAL, 5、粪便标本：采集杯总装入2ml生理盐水，如患者发病早期出现腹泻，则留取粪便3-5g（黄豆大小） 6、血液：标本使用含有EDTA抗凝的真空采血管采集血液标本2-4ml |
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| 标本存放时间过长（病毒核酸降解） |
1、采集后2-4h内送到实验室，血液标本室温送检，其他标本在2-8℃转运 2、若运送时间超过24H，标本应在-70℃或更低温度保存，短距离转运应在2-8℃下进行，长距离转运应采用冰运输。 |
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| 研究显示少数患者的感染不畏仅限下呼吸道，而不是鼻咽部 | 建议取下呼吸道的BAL用来做冠状病毒核酸检测 | ||
| 保存液问题，RNA保存液导致病毒颗粒沉淀，回收率降低 | 及时分离病毒核酸，避免使用高盐保存液，颜研发专项保护液。注意，病毒可以降解，要保护的是病毒RNA，而不是病毒颗粒，两者方法不一定是一致的。 | ||
| 试剂盒 | 纯化问题 | 60% | 选择合适RNA提取试剂盒 |
| 逆转录酶 | 选择优质颜料 | ||
| 引物探针设计局限性，病毒变异位点在设计位点上 | 与临床症状和CT表现不符，可以变换试剂盒 | ||
| 阳性对照品问题，用构建的质粒DNA或者PCR扩增产物来替代，但是DNA不参与提取和逆转录的过程控制，所以不能起到严格意义上的阳性对照 | 阳性对照品为包含ORF 1ab基因、N基因、内标基因扩增序列的假病毒，可以模拟样本中病毒核酸的原始状态，能够准确监测提取、逆转录、荧光定量检测全流程。 | ||
| 内参基因 | 用假病毒 | ||
| 实验室 | 核酸提取过程要求精细操作，对操作人员技术有较高要求，新冠病毒为单链RNA病毒，相对于DNA，RNA极易降解。 | 10% | 严格执行SOP,自动化、POCT是未来的方向 |
| 未做室内质控 | 实验室可利用阳性病人标本灭活后，或者利用提取的核酸标本纸杯批量的内部质控品，有的实验室已经有制备，阴性质控可以用试剂空白或 非新冠病毒感染病人的样本等 | ||
| 未参加室间质评 | 赶紧参加 | ||
| 报告解读与临床沟通 | 主动与临床医生沟通。 |
