真菌培养及鉴定

【真菌培养及鉴定】

1.采集标本 体表真菌的标本有毛发、皮屑、甲屑、痂等，标本在分离前常先用75%的乙醇消毒，真菌培养及鉴定。深部真菌的标本可根据情况取痰、尿液、粪便、脓液、口腔或阴-道分泌物、血液、脑脊液、各种穿刺液和活检组织，采集标本应注意无菌操作。

2.培养检查：可提高真菌检出率，并能确定菌种。标本接种于葡萄糖蛋白胨琼脂培养基(Sabouraud agar)上，置室温或37℃培养1～3周。必要时可行小培养协助鉴定。菌种鉴定常根据菌落的形态及显微镜下形态判断。对某些真菌，有时尚需配合其他鉴别培养基、生化反应、分子生物学方法确定。

真菌培养的方法与直接镜检法相比较而言，更能对大部分真菌感染的灰指甲作出准确的鉴定，也是诊断灰指甲的一个很重要的手段。下面我们就从培养基的选择、培养时间、菌种鉴定三方面来了解一下灰指甲的真菌培养法。

1.培养基的选择

通常培养真菌会同时选用两种培养基，如果单用一种培养基，则容易忽略其它种类的真菌诊断。常见的两种培养基，一种为沙氏葡萄糖琼脂培养基中加抗菌剂，常为氯霉素和放线菌酮;另一种是沙氏葡萄糖琼脂培养基中仅加氯霉素，不加放线菌酮。

2.培养时间

各种真菌的生长速度不同，所以报告的时间也不同。一般皮肤癣菌生长较缓慢，在26℃-28℃的环境下需要培养2-4周才能发报告，但是，皮肤癣菌含盖的菌种较多也需要区别对待;酵母菌生长较快，通常2-3就可以发报告，如果为阴性则需要观察1周;霉菌生长也比较快，一般2-4天就可以发报告。

3.菌种鉴定

(1)丝状真菌：包括皮肤癣菌和霉菌，根据菌落形成所需要的时间，在不同条件下生长的情况，菌落表面及背面的形态、色素，培养基中有无色素，培养物用乳酚棉蓝染色后镜检找特征性标志结构。(2)酵母菌：分为形态学鉴定及生化试验。形态学鉴定主要观察有无假菌丝产生，如有则为念珠菌属，如无则为念珠菌以外的酵母菌;生化试验最为常用的是API系统，用此法鉴定准确，但价格较贵，鉴定材料《真菌培养及鉴定》。

丝状真菌：主要是形态学的鉴定，如直接涂片观察，小培养显微镜鉴定，诱导形态观察(25℃与35℃下双相型真菌的特征孢子及菌丝的产生和两种菌落的形成及脑心浸液琼脂培养基，KT培养基，KelleyAgar培养基转相诱导，另外常用的还有皮肤癣菌VB1生长刺激，吴氏荧光检查，毛发穿孔试验及在特殊情况下进行的一些生化鉴定等。其中，小培养显微镜检对于丝状真菌的鉴定，特点是动态直观，易于观察，且节约材料。解放军总医院第一附属医院皮肤科马天

(2)酵母菌鉴定：形态学鉴定主要是玉米吐温诱导下特征菌丝及特征孢子的检验，血清芽管形成，而在形态学基础上还必须进行生化鉴定：有标准鉴定，自动仪器鉴定，显色鉴定，其中，自动仪器鉴定(如API20C，ID32C等)，显色鉴定对于酵母样真菌的鉴定，特点是快速简便;标准鉴定是按传统双歧表流程鉴定(包括糖同化试验，糖发酵试验，CAFC酚氧化酶试验，尿酶试验，KNO3同化试验，脂肪酸需求试验)，是真菌鉴定的金标准，系统准确，缺点是程序繁琐，耗时长，与临床治疗不太适应。此外，还有血清学玻片凝集试验，动物致病性实验，分子生物学鉴定：如核酸杂交，DNA探针杂交，PCR扩增序列分析，PCR-SSCP单链构象多态性分析，PCR-RFLP限制性片段长度多态性分析，PCR-RAPD随机扩增多态性分析，PFCG脉冲电泳核型分析等。

对于酵母样真菌首选CHROMagar念珠菌显色培养基，而显色培养基不能鉴定的酵母样真菌可采用自动仪器YBC卡进行鉴定或API板;条件较差的实验室可采用传统标准鉴定法中鉴定值较高的试验，如酚氧化酶鉴定新型隐球菌(+)，尿素区分毛孢子菌属(+)，地丝菌属(-)，念珠菌属(-)(克柔念珠菌/溶脂念珠菌+)，球拟酵母属(-)，隐球菌属(+)，玉米-土温培养基上产菌丝区分念珠菌属(+)与球拟酵母属(-)，隐球菌属(-)与毛孢子菌属(+)，地丝菌属(+)。而同化试验推荐平皿法，一个平皿内可观察多种糖类的同化情况，且结果易于观察，重复性好。对于丝状真菌及双相型真菌，可采用小培养法，快速简便易于观察。而对于双相型真菌还须经过脑心浸液培养基转相试验后确证。而血清学及分子生物学则主要用于流行病学和一些难培养难鉴定真菌的检验，由于成本高或要求技术难度较高，故而不适合在常规工作中采用。