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【微生物检验笔记】第19章 肠杆菌科及检验(下)
【志贺菌属】
俗称痢疾杆菌，据生化和血清学分类分为褔氏、痢疾、鲍氏、宋内氏志贺菌四群，19891年CDC将生化形状相近的A、B、C群归为一群，统称ABC血清型，将鸟氨酸脱羧酶阳性的宋内氏志贺菌单列出来，我国以褔氏和宋内氏引起的痢疾最为常见。
一：生物学特性
1、形态和染色，革兰阴性短杆菌，2-3μm*0.6-0.7μm，无荚膜、无芽孢，无鞭毛（无动力），肠道选择培养基上半透明灰白色菌落—-因为不产乳糖（宋内志贺菌形成粗糙型菌落，其他则是光滑型菌落），有菌毛。
2、培养特性，需氧或兼性厌氧，液体培养基中呈浑浊生长，在普通琼脂和SS平板上形成中等大小、半透明的光滑菌落。松内志贺菌可形成扁平、粗糙的菌落。
3、生化反应，志贺菌属， 不分解乳糖（灰白色菌落） KIA：K/A，产气：-/+，H2S：- ，MIU：动力：- ，吲哚：+/- ，尿酶：- ，不产赖氨酸脱羧酶。
4、志贺菌属只有O抗原，不鞭毛抗原，个别菌型及新分离菌株有K抗原。——无H抗原。
二、致病性
侵袭力：菌毛粘附于肠粘膜细胞，诱导细胞内吞；
内毒素：破坏肠粘膜，肠壁通透性，肠壁植物神经—腹痛、腹泻、里急后重，粘液脓血便
外毒素（志贺毒素，ST）：肠毒素活性，细胞毒活性，神经毒活性
所致疾病：细菌性痢疾（菌痢）
1、急性菌痢
2、中毒性菌痢
3、慢性菌痢。
传染源为病人和带菌者，经粪口途径传播。
三 微生物学检验
1、标本采集
尽可能在发病早期及治疗前（即：未使用抗生素之前）采集新鲜粪便，选择脓血便或粘液便，必要时可用肛拭子采集。
2、检验方法和鉴定
（1）分离培养：取粪便（粘液或脓血部分）或肛拭标本接种GN肉汤增菌及再进行分离培养。一般同时接种强弱选择性不同的两个平板。强选择鉴别培养基可用沙门、志贺均强选择培养基（SS）；弱选择培养基可用麦康凯（MAC）或中国蓝培养基。灰白色半透明的S型菌落，培养18-24h后选取可疑菌落进行下列鉴定。同时还要与非发酵菌中的类志贺和邻单胞菌鉴别（志贺无动力，氧化酶阴性—整个肠杆菌科菌都为阴性）、与沙门（志贺无动力无硫化氢）（沙门还可以用沙门的诊断血清）。
（2）鉴定
1）初步鉴定：挑选可疑菌落3-4个先用志贺菌属多价诊断血清作试探性拨片凝集试验。将试探性凝集试验阳性的菌落至少接种2-3支KIA或MIU，经35 oC培养18-24h，凡符合 KIA：K/A，产气：-/+，H2S：- ，MIU：动力：- ，吲哚：+/- ，尿酶：- ，并结合试探性拨片凝集试验阳性结果可鉴定为志贺氏菌属。
2）最后鉴定：
与志贺邻单胞菌和伤寒沙门菌的鉴别：可用动力和氧化酶加以鉴别，志贺菌为阳性，而类志贺邻单胞菌为阳性。伤寒沙门菌硫化氢和动力阳性，能与沙门菌属因子血清（O多价A-F群或Vi）凝集而不与志贺菌属因子血清凝集。
4、防治原则
人工免疫不理想，目前治疗细菌性痢疾一般首选氟喹诺酮类抗生素。
【沙门菌属】
一、生物学特性
1、形态与染色：直杆菌（0.7-1.5）*（2.0-5.0），无芽胞，无荚膜的革兰氏隐形直杆菌。除鸡沙门外都有周鞭毛，能运动，多数有菌毛。
2、培养特性：灰白色半透明菌落，营养要求不高，在普通琼脂培养基上即能生长，在液体培养基中呈均匀浑浊。在SS琼脂和麦康凯琼脂培养基上35-37 oC 24h可形成直径约2-4mm的透明或半透明菌落，对胆盐耐受。产硫化氢者在SS琼脂上形成黑色中心。
3、生化反应：除亚利桑那菌（在XLD培养基上为黑心、培养基黄色）均外均不发酵乳糖，大多数IMViC试验为-+-+，KIA：K/A，产气：+/- ，H2S：+/- ，MIU：动力：+ ，吲哚：- ，尿酶：+
4、抗原结构：主要由O抗原和H抗原组成，部分菌株有类似大肠杆菌K抗原的表面抗原，与细菌的毒力有关，故称Vi抗原。
（1）O抗原：即菌体抗原，有58种，以阿拉伯数字依次标记；根据沙门菌有共同的O抗原这一特点，分类学者将有共同抗原的细菌归为一组，这样就使沙门菌分为42群（或组）。即A、B、C、……、Z和O16-O67群。每群都有群特异性抗原，如A群02、B群04、D群09等。。。。
——————疑惑备注：——-<可能有的菌上面不止含有一种O抗原？要不怎么会有58种变为42群呢？>
（2）H抗原：即鞭毛抗原。H抗原是定型的依据。
沙门菌H抗原有两个相，第一相为特异性抗原，用a、b、c……表示，第二相为共同抗原，用1、2、3、……表示。
（3）表面抗原：已证实沙门菌属有Vi、M和5抗原三种。Vi抗原加热60 oC30min或经石炭酸处理被破坏，其存在时间可阻止O抗原与相应抗体发生凝集。
5、变异性
（1）S-R变异：菌落光滑型经人工培养传代后逐渐变成粗造型，此时菌体表面的特异多糖抗原丧失，在生理盐水中可出现自凝。
（2）H-O变异：指有鞭毛的沙门菌失去鞭毛的变异；
（3）相位变异：具有双相H抗原（第1相位特异相，第2相为非特异相）的沙门菌变成只有其中某一相H抗原的单相菌，称相位变异。
（4）V-W变异：失去全部Vi抗原的变异。
二、致病性
致病因素有：侵袭力、内毒素、肠毒素3种，临床上可引起胃肠炎、肠热症、菌血症或败血症等。其中肠热症属法定传染病。
1、肠热症：即伤寒与副伤寒病。由伤寒与副伤寒沙门菌所引起的慢性发热症状，为法定传染病之一。
2、食物中毒：引起食物中毒的沙门菌以属伤寒、肠炎、汤卜逊、猪霍乱、乙型及丙型副伤寒沙门菌为常见。
3、慢性肠炎：沙门菌可引起老人和儿童的慢性肠炎。
4、败血症：多由猪霍乱沙门引起。
5、沙门菌的局部感染如：颈部、腰部
三、微生物学检验
1、标本采集（很重要）：根据不同疾病采取不同的标本进行分离与培养。肠热症的第一、二周采血液，第二、三周采集粪便与尿液（细菌已侵入胆囊和肾脏）。整个病程中骨髓分离细菌阳性率较高。食物中毒采集食物与粪便。
2、检验方法及鉴定
（1）分离培养
1）粪便：一般将粪便或肛拭直接接种于SS和麦康凯平板上，用两种培养基的目的是为了提高标本的阳性检出率。
2）血液和骨髓：抽取患者血液5ml或骨髓0.5ml，立即接种于含0.5%胆盐肉汤5ml试管中增菌，48h将培养物移种到血平板和倡导鉴别培养基上，若有细菌生长取出涂片革兰染色并报告结果。对增菌培养物连续培养7天，仍无细菌生长时，则报告阴性。
3）尿液：去尿液2-3ml经硫磺酸盐肉汤增菌后，再接种于肠道选择培养基或血平板上进行分离培养，亦可将尿液离心沉淀物分离培养。
4）局部感染的脓液。
（2）鉴定：沙门菌属的鉴定与志贺菌属相同，须根据生化反应和血清学鉴定两方面进行。
1）初步鉴定：如为革兰阴性均时作氧化酶试验，阴性时，跳去可疑菌落分别移种与KIA和MIU上，并作生化反应。以沙门菌多价血清作玻片凝集试验。
凡符合KIA：K/A，产气：+/- ，H2S：+/- ，MIU：动力：+ ，吲哚：- ，尿酶：+ ，硝酸盐还原+，以沙门菌多价血清玻片凝集试验阳性，鉴定为沙门菌属。
2）最后鉴定：沙门菌血清学鉴定主要借助于沙门菌O抗原多价血清与O、H、Vi抗原的单价因子血清。甲型副伤寒、鼠伤害沙门菌、和伤害沙门菌分别属于A、B、D血清群。
3）血清学诊断：肥达试验：用已知的伤寒沙门菌O、H抗原，甲乙丙副伤寒沙门菌H抗原稀释后与被检血清作定量凝集试验，以检测患者血清中抗体的含量，来判断集体是否受沙门菌感染而导致肠热症丙判别沙门菌的种类。
四、防治原则
加强饮食卫生，防治污染食品及水源经口感染，携带者积极治疗，皮下注射死菌苗或口服减毒活疫苗是预防沙门菌属传染的几个主要措施。临床治疗是根据体外药敏试验结果选用合适抗生素，保持水电解质的平衡，对并发症积极处理，如肠出血、肠穿孔、胆囊炎、心肌炎等。对于伤寒沙门菌感染，可选择的抗生素有氯霉素、氟喹诺酮类、氨苄西林、复方新诺明、三代头孢等。
【变形杆菌属、普罗威登斯菌属、摩根菌属】—属于肠道寄居的正常菌群—都属于苯丙氨酸脱氨酶阳性细菌–条件致病
变形杆菌属（四个种）：普通变形杆菌、奇异变形杆菌、产粘变形杆菌、潘氏变形杆菌；
普罗威登斯菌属（四个种）：产碱普罗威登斯菌、斯氏普罗威登斯菌、雷极普罗威登斯菌、P.rustigianii；
摩根菌属（仅有一个种）：摩根摩根菌；H-O变异，37 oC以上培养物
一、生物学特性
1、形态与染色：GNR。两端钝圆，有明显多型性，呈球状或丝状，有周身鞭毛，运动活跃；摩根菌的部分菌株在30 oC 以上环境培养时不形成鞭毛，无芽孢、无荚膜。
2、培养：需氧或兼性厌氧，对营养物特殊要求，生长温度10-43 oC，在普通琼脂和血琼脂平板上普通变形杆菌和奇异变形杆菌呈迁徙扩散生长现象（即：迅速形成波纹状薄膜而布满整个培养基平板表面）；普罗威登斯菌和摩根菌物迁徙生长现象；在含胆盐的培养基表面，菌落呈扁平、圆形、半透明，在含有铁和铅离子的培养基中产硫化氢的菌株菌落中心呈黑色，SS培养基上有与沙门菌和志贺菌相似的菌落特征；在液体培养基中迅速生长，早期培养物呈浑浊，部分可有沉淀。
3、生化反应—–该三属菌的共同特点是氧化酶阴性、苯丙氨酸酶阳性的革兰阴性杆菌
该三属菌的区别：
| 变形杆菌属 | 普罗威登斯菌属 | 摩根菌属 | |
| 迁徙生长 | + | – | – |
| 硫化氢产生 | + | – | – |
| 液化明胶 | + | – | – |
| 酯酶 | + | – | – |
| 鸟氨酸脱羧酶 | – | – | + |
| 枸橼酸盐利用 | – | + | – |
变形杆菌属的种的鉴别：
| 靛基质 | 麦芽糖 | 鸟氨酸脱羧酶 | 木糖发酵 | 氯霉素敏感性 | |
| 普通变形杆菌 | + | + | – | + | 2群：V/3群：S |
| 奇异变形杆菌 | – | – | + | + | S |
| 产粘变形杆菌 | – | + | – | – | S |
| 潘氏变形杆菌 | – | + | – | + | R |
S:>14mm
普罗威登斯菌属的种的鉴别：
| 尿素 | 蕈（xun）塘（海藻糖） | 侧金盏花醇 | 枸橼酸利用 | |
| 产碱普罗威登斯菌 | – | – | + | + |
| 斯氏普罗威登斯菌 | + | + | – | + |
| 雷氏普罗威登斯菌 | + | – | + | + |
| P.rustigianii（拉氏普罗威登斯菌） | – | – | – | – |
二、致病性
1、变形杆菌属：普通变形杆菌和奇异变形杆菌引起尿道、创伤、烧伤感染，引起尿路感染仅次于大肠埃希菌。普通变形杆菌还可引起多种感染和食物中毒，奇异变形杆菌还可引起婴幼儿肠炎。本菌属细菌具有O抗原及H抗原，普通变形杆菌OX19 、OX2 、OXk 的菌体抗原与某些立克次体有共同抗原，这就是外-斐（Well-Felix）反应，用以诊断某些立克次体病的依据。
2、普罗威登斯菌属：引起烧伤、创伤和尿路的感染。
3：摩根菌属：本属细菌为医源性感染的重要病原菌之一，可导致泌尿道感染和伤口感染。
三、微生物学检验
1、标本采集：根据病情：尿液、浓汁、伤口分泌物、婴儿粪便；
2、检验方法及鉴定
（1）直接涂片：尿液、脑脊液、胸腹水等离心沉淀后取沉淀物涂片；脓液和分泌物则直接涂片，行革兰染色后观察细菌形态及染色特性；
（2）分离培养：将各类标本分别接种于血琼脂平板和麦康凯或伊红美蓝（EMB）琼脂平板；或SS琼脂和麦康凯琼脂平板上，孵育35-37 oC18-24h后挑选菌落。为了抑制变形杆菌属菌的迁徙生长，可于血琼脂中加入石碳酸或苯乙醇，使其终浓度为1g/ml和0.25%，这并不影响其他细菌的分离。变形杆菌属在血琼脂上呈迁徙生长，在肠道选择培养基上形成不发酵乳糖菌落，在SS琼脂上常委有黑色中心的菌落。
（3）鉴定：接种前述生化培养基，并作氧化酶试验。
【耶尔森菌属】
本属菌包括11个种，其中鼠疫耶尔森菌、假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌 肯定与人类致病有关
一、鼠疫耶尔森菌
鼠疫耶尔森菌俗称鼠疫杆菌，是烈性传染病鼠疫的病原菌。鼠疫是自然疫源性传染病，通过直接接触染疫动物或节肢动物叮咬而感染。临床常见腺鼠疫、败血型鼠疫和肺鼠疫。
1、生物学特性
（1）形态与染色：鼠疫耶尔森菌为革兰阴性杆菌，短而粗，两端钝圆，两极浓染，大小为（1.0-2.0）μm-*（0.5-0.7）μm。有荚膜，无鞭毛，无芽孢。陈旧培养物或3%NaCL琼脂培养基上呈明显多形性。
（2）培养：需氧和兼性厌氧，在普通培养基上即可生长。最适温度：28-30 oC。培养基最适pH为6.9-7.1，培养16-18h，用显微镜观察可见一层形状不一，浅灰色小菌落，这是鼠疫耶尔森菌培养初期的菌落特征，有一定的鉴别意义。在培养24-48h后可形成0.1-0.2mm，圆形。中心突出，透明的浅灰色小菌落。72h后菌落直径可达4mm。在液体培养基中生长良好，开始浑浊生长，24h后为沉淀生长，48h后形成菌膜，稍加震动菌膜呈钟乳石状下垂。
（3）生化反应：不活跃，在双糖铁培养基上课分解葡萄糖，少数菌株可分解乳糖，不产生硫化氢，MIU培养基无动力，不产生靛基质，尿素酶试验阴性。
2、微生物学检验
（1）标本采集：血液、痰、淋巴结穿刺液
（2）检验方法及鉴定：鼠疫耶尔森菌为甲类病原菌，传染性极强，故操作过程应严格遵守操作规程，要求实验室有隔离设施，防鼠、防蚤和严密的个人防护隔离措施；用过的试验器材及物品随时消毒处理。
1）直接涂片排查：一般制备两张片，分别用于革兰染色和美兰染色，可见革兰阴性球杆菌，形似芝麻，两端浓染。
2）分离培养：鼠疫耶尔森菌细菌学检验分离培养步骤十分重要，分离培养时未污染标本可直接接种血培养，污染标本则需要接种选择性培养基（如：龙胆紫亚硫酸钠琼脂）。经28 oC-30 oC培养24-48h后，挑取菌落作鉴定。
3）鉴定：根据菌落特征，细菌形态和肉汤中呈“钟乳石”状发育，KIA结果利用葡萄糖，不利用乳糖，不产硫化氢，MIU均为阴性反应。为作最后鉴定应补充一下实验方法：
-1）噬菌体裂解试验
-2）动物试验
-3）免疫学方法
二、小肠结肠炎耶尔森菌
1、生物学特性
（1）生物学特性
（1）形态与染色：菌体(1-2)μm*（0.5-1）μm，25 oC培养时形成周鞭毛，呈翻滚旋转状运动，37 oC培养无动力，无芽孢，无荚膜的革兰阴性球杆菌。
（2）培养：需氧或兼性厌氧，4 oC-40 oC均能生长，最适生长温度为20-28 oC。普通营养琼脂上生长良好，在血琼脂平板上，形成直径1-2mm，圆形光滑，凸起的菌落。能在选择性培养基如麦康凯培养基上生长，形成不发酵乳糖的无色、透明或半透明、扁平、较小的菌落。在SS琼脂上生长不良。液体培养基中呈浑浊生长，液体表面可形成白色菌膜或有沉淀生成。
（3）生化反应：分解葡萄糖和蔗糖产酸不产气，绝大多数菌株不发酵乳糖，硫化氢阴性，脲酶阳性，靛基质不定。VP试验25 oC阳性，37 oC阴性，鸟氨酸脱羧酶阳性。
2、致病性
（1）致病因素：侵袭力、肠毒素
（2）本菌为人畜共患菌，动物感染后多无症状，通过消化道传播引起人类肠道感染性疾病。根据感染后定居部位不同，可分为小肠结肠炎、末端回肠炎、胃肠炎、阑尾炎和肠系膜淋巴结炎。出肠道感染外伤口发生败血症，结节性红斑及关节炎等。
3、微生物学检验
（1）标本采集：标本来自被检者粪便、血液、尿液、食物或脏器组织等
（2）检验方法及鉴定：
1）分离培养：粪便标本可直接接种于麦康凯、NyE（耶尔森选择性琼脂）或SS琼脂，亦可将标本接种于5ml、pH7.4，,1mmol.L磷酸盐缓冲液（PBS）中，如为食物标本在研碎后加10倍量的上述PBS，置4 oC冰箱，分别于7、14、21天取上述含菌PBS0.1ml接种于肠道菌选择性琼脂平板，置25 oC培养24-48h后，挑取可以小肠结肠炎耶尔森菌菌落进一步坚定。
2）鉴定：根据菌落形态，革兰染色的典型形态，氧化酶试验阴性，30 oC以下培养液暗视野观察，其动力呈翻滚状态，KIA只利用葡萄糖，MIU试验22 oC动力阳性，37 oC无动力，脲酶试验阳性，即可作出初步鉴定。
血清学鉴定：用小肠结肠炎耶尔森菌O因子血清与待检菌作玻片凝集试验。
三、假结核耶尔森菌
假结核耶尔森菌是鼠疫耶尔森菌的近缘菌，可使啮齿动物家畜和禽类致病，病通过污染食物导致人类感染。人类感染少见，偶见肠道感染及肠系膜淋巴结炎。
菌体呈球形或短杆形，两端浓染。25 oC培养有周鞭毛，有动力，37 oC培养无动力。
兼性厌氧，最适生长温度30 oC，pH6.0-8.0，普通营养琼脂上易生长，发育较快，37 oC24h形成圆形，中心凸起，呈颗粒状，灰黄色，半透明的菌落，血琼脂平板上不溶血，SS琼脂上不生长，能在含胆盐培养基或麦康凯培养基上生长。在液体培养基中呈均匀浑浊生长者为光滑型菌株，沉淀生长者为粗造型菌株。
