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【微生物检验笔记】第13章 细菌的生物化学实验
发布时间：2013/07/14 微生物检验 标签：CAMP试验DNA酶试验KIA试验MIU试验O/129抑菌试验O/F试验ONPG试验Optochin试验V-P试验vpβ-半乳糖苷酶试验七叶苷水解试验丙二酸盐利用试验凝固酶试验卵磷脂酶试验各种酶类试验吲哚（靛基质）试验复合生化试验奥普托欣试验尿素分解试验微生物检验笔记抑菌试验明胶液化试验杆菌肽试验枸橼酸盐利用试验氧化/发酵试验氧化酶试验氨基酸脱羧酶试验甲基红试验硝酸盐还原试验硫化氢试验碳水化合物代谢试验碳源和氮源利用试验糖胆汁溶菌试验脂酶试验苯丙氨酸脱氨酶试验苷类发酵试验蛋白质和氨基酸代谢的试验触媒试验过氧化氢酶试验醇浏览次数：557 欢迎阅读！
1、碳水化合物代谢试验
（1）糖、醇、苷类发酵试验
（2）氧化/发酵试验（O/F试验）
（3）β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）
（4）七叶苷水解试验
（5）甲基红试验
（6）V-P试验
2、蛋白质和氨基酸代谢的试验
（1）明胶液化试验
（2）吲哚（靛基质）试验
（3）硫化氢试验
（4）尿素分解试验
（5））苯丙氨酸脱氨酶试验
（6）氨基酸脱羧酶试验
3、碳源和氮源利用试验
（1）枸橼酸盐利用试验
（2）丙二酸盐利用试验
4、各种酶类试验
（1）氧化酶试验
（2）过氧化氢酶试验（触媒试验）
（3）硝酸盐还原试验
（4）脂酶试验
（5）卵磷脂酶试验
（6）DNA酶试验
（7）凝固酶试验
（8）CAMP试验
（9）胆汁溶菌试验
5、抑菌试验
（1）O/129抑菌试验
（2）杆菌肽试验
（3）奥普托欣（Optochin）试验
6、复合生化试验
（1）KIA试验
（2）MIU试验
1、碳水化合物代谢试验
（1）糖、醇、苷类发S酵试验
原理：主要里主要利用细菌含有不同发酵不同糖、醇、苷的酶、分解代谢产物中产酸、产气有的仅产酸，故而据此鉴别细菌
培养基：在培养基中加入0.5-1%的糖或醇或苷的培养基
运用：鉴定细菌最基本、最重要的试验，尤其对肠杆菌科细菌最重要。
（2）氧化/发酵试验（O/F试验）
原理：区分细菌代谢类型
培养基：HL（Hogh-leifson）培养基
方法：将待检菌同事接种2支HL培养基，其中一支加不少于1cm的液体石蜡封闭，置35oC培养48h
结果：
| 开管 | 封闭管 | |
| 产碱型 | – | – |
| 氧化型 | + | – |
| 发酵型 | + | + |
【肠杆菌科大多是兼性厌氧的，属于发酵型细菌，非发酵菌只能有氧下分解葡萄胎甚至是不分解葡萄胎的产碱型细菌，葡萄糖球菌属是兼性厌氧菌，微球菌属是氧化型细菌】
（3）β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）
原理：
试剂：0.75M ONPG溶液
方法：从克氏双糖培养基上取菌，于0.25ml生理盐水中制成菌悬液，加入一滴甲苯并充分振荡，使酶释放。然后将试管37oC水浴5min，加入0.25ml ONPG试剂，水浴20min-3h观察结果。
结果：菌悬液呈黄色为阳性反应，一般在20-30min之内显黄色，
运用：迅速及迟缓发酵乳糖的细菌ONPG试验均阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本试验主要用于迟缓发酵乳糖的细菌的快速鉴定。
（4）七叶苷水解试验
原理：
培养基：七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基
结果：接种细菌后培养基变黑色为阳性，不变色为阴性
运用：主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。
（5）甲基红试验（MR试验）（M试验）
原理：
甲基红在pH下降到4以下时显红色
培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基
方法：将待检细菌接种于上述培养基培养2-4天，于试管内滴加甲基红，立即观察结果。
结果：呈红色为阳性，橘红色为弱阳性，黄色为阴性
运用：主要用于鉴别大肠埃希菌和产气肠杆菌，前者阳性，后者阴性。肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变性杆菌属为阳性，而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属为阴性。
（6）V-P试验(VP试验)（vp试验）
原理：
培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基
方法：将待检菌接种于上述培养基，35oC培养48h后加入甲液（6%α萘酚溶液）和乙液（40%KOH溶液），振摇。
结果：数分钟内出现红色为阳性，如红色出现且35oC 4h之后忍如故着为阴性。
运用：本试验常与甲基红试验一起配合使用，因为前者阴性的细菌，后者常为阳性。
2、蛋白质和氨基酸代谢的试验
（1）明胶液化试验
原理：
方法：将被检菌穿刺接种于明胶培养基，22oC培养7d,逐日观察结果，若使用35oC孵育，因明胶在此温度下可自行液化，故在观察结果之前先置于4oC冰箱30min,再看结果。
结果：培养基呈液化状态为阳性结果
运用：肠杆菌科细菌的鉴别，如沙雷、普通变性杆菌、奇异变性杆菌、阴沟杆菌等可液化明胶，而其他细菌很少液化明胶，有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌也能液化明胶，另外多数假单胞菌也能液化明胶。
（2）吲哚（靛基质）试验
原理：
培养基：蛋白胨水培养基
方法：将细菌接种到培养基，35oC培养24-48h后，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂
结果：于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性
运用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定
（3）硫化氢试验
原理：
培养基：醋酸铅培养基
方法：将细菌接种培养基，35oC培养24-48h后观察结果
结果：培养基变黑为阳性，不变色为阴性
运用：主要用于肠杆菌科中属和种的鉴别，如沙雷菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属细菌，绝大多数硫化氢试验阳性，其他菌属阴性。沙门菌属中也有硫化氢试验阴性的菌种。
（4）尿素分解试验
原理：
培养基：尿素培养基
方法：将待检菌接种于尿素培养基，35oC培养18-24h后观察结果
结果：培养基变呈碱性，使酚红指示剂变红色为阳性，不变色为阴性
运用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属的鉴定，奇异变型杆菌和普通变型杆菌脲酶阳性，另外雷氏普罗维登菌和摩根菌为阳性，而斯氏和产碱普罗维登菌阴性
（5））苯丙氨酸脱氨酶试验
原理：
培养基：苯丙氨酸琼脂培养基
方法：将苯丙氨酸浓厚接种于苯丙氨酸琼脂培养基斜面上，于35培养18-24h，滴加10%三氯化铁试剂3-4滴，自斜面上方流下。
结果：出现绿色为阳性。应立即观察结果，延长反应时间会引起褪色。
运用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定，变形杆菌属、普罗维登斯菌属和摩根菌属均为阳性，肠杆菌种中其他细菌均为阴性。
（6）氨基酸脱羧酶试验
原理：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其分解脱羧生成胺（赖氨酸->尸胺，鸟氨酸->腐胺，精氨酸->精胺），和二氧化碳，是培养基变碱，使指示剂显示出来。
培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基，
方法：将被检菌分别接种于赖氨酸（或鸟氨酸或精氨酸）培养基和氨基酸对照培养基中，并加入无菌液体石蜡或矿物油，于35oC培养1-4d，每日观察结果。
结果：对照管呈黄色、测定管呈紫色（指示剂为溴甲酚紫）为阳性，测定管为黄色为阴性，若对照管为紫色则试验无意义，不能做出判断。
运用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定， 如沙门菌属中，除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性，志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外其他志贺菌均为阴性。
3、碳源和氮源利用试验
（1）枸橼酸盐利用试验
原理：某些细菌能以铵盐为唯一氮源， 并且利用枸橼酸盐作为唯一的碳源，可在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐，使培养基变碱
培养基：枸橼酸盐培养基
方法：接种后35oC培养1-4d，每日观察结果
结果：培养基基中的溴麝香草酚兰有浅绿色变为深蓝色为阳性；不能利用枸橼酸盐作为碳源的细菌，不能再此培养基上生长，培养基不变色为阴性
运用：用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。在肠杆菌科中，埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属皆为阴性，沙门菌属、克雷伯菌属通常为阳性。
（2）丙二酸盐利用试验
原理：有的细菌可利用丙二酸盐作为唯一碳源，将丙二酸盐分解为碳酸钠使培养基变碱
培养基：丙二酸盐培养基
方法：将被检菌接种于上述培养基，35oC培养24-48h观察结果
结果：培养基有浅绿变为深蓝色为阳性，不变色为阴性
运用：肠杆菌科中属及种的鉴别，克雷伯菌属为阳性，枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属中有些菌种也呈阳性，其他菌属皆为阴性。
4、各种酶类试验
（1）氧化酶试验
原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶
试剂：1%盐酸四甲基对苯二胺或1%盐酸二甲基对苯二胺
方法：
1）菌落法：直接滴加试剂于菌落上
2）滤纸法：取洁净滤纸一小块，沾取菌少许，然后加试剂
3）试剂纸片法：将滤纸浸泡于试剂中制成试剂纸片，取菌涂于试剂纸上
结果：细菌在与试剂接触10s内呈深紫色，为阳性。为确保结果的准确性，分别用铜绿假单胞菌和大肠埃希菌分别做阳性对照和阴性对照
运用：主要用于肠杆菌科细菌和假单胞菌的鉴别，前者阴性，后者阳性。奈瑟菌属、莫拉菌属也呈阳性反应。
（2）过氧化氢酶试验（触媒试验）
原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧而出现气泡。
试剂：3%过氧化氢溶液
方法：取菌置于洁净的试管内或玻片上，然后加3%的过氧化氢数滴，或者直接滴加3%的过氧化氢数滴于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。
结果：有大量气泡产生者为阳性结果，不产生气泡为阴性结果。
运用：革兰阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌菌产生过氧化氢酶，而链球菌属为阴性，故可用此来对革兰阳性球菌初步分群。
（3）硝酸盐还原试验
原理：硝酸盐还原反应包括两个过程：在化合过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再有氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物；二是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸盐还原的细菌从硝酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其他还原性产物。但硝酸盐还原的过程因细菌不同而异，有的细菌仅是硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌；有的细菌则可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；有的细菌嫩使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮，如假单胞菌等。硝酸盐还原试验系统测定还原过程所产生的亚硝酸盐。
培养基：硝酸盐培养基
试剂：甲液（对氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸100ml）；乙液（α-萘胺0.5g+5mol/L醋酸100ml）
方法：被检菌接种于硝酸盐培养基中，于35oC培养1-4天。将甲、乙液等量混合后（约0.1mling）加入培养基内，立即观察结果。
结果：出现红色为阳性。若加入世纪后无颜色反应，可能是：1）硝酸盐没有被还原，试验阴性；2）硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而导致假阴性结果，这是应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产红色，表示试验为假阴性。
运用：广泛用于细菌鉴定。肠杆菌科细菌巨额能还原硝酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌可产生氮气；有些厌氧菌如韦荣球菌试验也为阳性。
（4）脂酶试验
原理：有的细菌产生脂酶，可分解脂肪成游离的脂肪酸。从而使培养基中与脂肪结合形成无色化合物的维多利亚蓝释放出来，呈现深蓝色。
培养基：脂酶培养基（含维多利亚蓝）
方法：将被检菌接种于上述培养基中，于37oC培养24h。
结果：培养变为蓝色为阳性，阴性为粉红色或无色。
运用：主要用于厌氧菌的鉴别。类杆菌中的中间类杆菌产生脂酶，其他类杆菌则阴性；芽孢梭菌属中产芽孢梭菌、肉毒梭菌和诺维梭菌也有此酶，而其他梭菌阴性。
（5）卵磷脂酶试验
原理：有的细菌产生卵磷脂酶（α-毒素），在钙离子存在时，此酶可迅速分解卵磷脂，生成浑浊沉淀状的甘油酯和水溶性磷酸胆碱。
培养基：1%卵黄琼脂平板
方法：将被检菌划线接种或点种与卵黄琼脂平板上，于35oC培养3-6h。
结果：若3h后再菌落周围形成乳白色浑浊环，即为阳性，6h后混浊环可扩展至5-6mm。
运用：主要用于厌氧菌的鉴定。产气荚膜梭菌、诺维梭菌产生此酶，其他梭菌为阴性。
（6）DNA酶试验
原理：某些细菌产生DNA酶，可使长链DNA水解成寡核苷酸链。因为长链DNA可被酸沉淀，寡核苷酸则溶于酸，所以当在菌落平板上加入酸后，会在菌落轴为出现透明环。
培养基：0.2%DNA琼脂平板
方法：将被检菌点种于上述平板上，于35oC培养18-24h，然后用1mol/L盐酸覆盖平板，观察结果。
结果：在菌落周围出现透明环为阳性，无透明环为阴性。
运用：在革兰阳性球菌中只有金黄色葡萄球菌产生DNA酶，在肠杆菌科中沙雷菌和变形杆菌产生此酶，故本试验可用于细菌的鉴别。
（7）凝固酶试验
原理：
方法：
1）拨片法：去兔血浆和盐水个一滴，分别置于结晶的玻片上，跳去被检菌分别与血浆和盐水混合。
2）试管法：去试管2支，各加0.5人或兔血浆，跳去贝建军和阳性对照菌分别加入血浆中并混匀，于37oC水浴3-4h。
结果：玻片法以血浆中有明显的颗粒出现而盐水中无自凝现象判为阳性；试管法以血浆凝固判为阳性。
运用：作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标，也是葡萄球菌鉴别时常用的一个试验。
（8）CAMP试验
原理：B群链球菌能产生CAMP因子，可促进葡萄球菌的β-溶血素溶解红细胞的活性，因此在两菌（B群链球菌和葡萄球菌）的交界处溶血力增加，出现矢形（半月形）的溶血区。
培养基：血琼脂平板
方法：先以产β-溶血素的金黄色葡萄球菌划一横线接种月血琼脂平板上，再将被检菌与前一划线作垂直划线接种，两线不能相交，相距0.5-1cm,于37oC培养18-24h，观察结果。每次试验都应设阴性对照和阳性对照。
结果：在划线交界处出现箭头样的溶血区为阳性。（如下图）
运用：在链球菌中，只有B群链球菌CAMP试验阳性，故可作为特异性鉴定。
（9）胆汁溶菌试验
原理：胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌，可能是由于胆汁降低细胞膜表面的张力，使细胞膜破损或使细菌裂解；或者是由于胆汁加速了肺炎链球菌本身自溶过程，促使细菌发生自溶。
试剂：10%去氧胆酸钠或醇牛胆汁
方法：
1）平板法：去10%去氧胆酸钠溶液一接种环，滴加于被检测菌菌落上，置35oC 30min后观察结果。
2)试管法：被检菌培养物2支，各0.9ml，分别加入10%去氧胆酸钠溶液和生理盐水（对照管）0.1ml，摇匀后置35oC水浴10-30min，观察结果。
结果：平板法以“菌落消失”判为阳性，试管法以“加胆盐的培养物变透明，而对照管仍浑浊”判为阳性。
运用：主要用于肺炎链球菌与甲型链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。
5、抑菌试验
（1）O/129抑菌试验
原理：O/129（二氨基蝶啶）对弧菌属细菌有抑制作用，而对气单胞菌属细菌无抑制抑制作用。
培养基：碱性琼脂平板
方法：将待检菌均匀涂布与碱性琼脂平板上，镊取O/129纸片（含药40μg）贴于平板上，35oC培养18-24h观察结果。
结果：出现抑菌环为敏感，无抑菌环为耐药。
运用：用于弧菌科的属间鉴别，弧菌属、邻单胞菌属对O/129敏感， 而气单胞菌属耐药。
（2）杆菌肽(bacitracin)试验
原理：A群链球菌对杆菌肽几乎全部敏感，而其他群链球菌绝大多数对其耐药。
培养基：血琼脂平板
方法：将待检菌纯培养物（肉汤）均匀涂布与血液琼脂平板上，稍干后贴上0.04U/片的杆菌肽纸片，35oC培养18-24h观察结果。
结果：抑菌环直径>10mm为敏感，抑菌环直径<10mm为耐药。
运用：用于A群链球菌与非A群链球菌的鉴别。
（3）奥普托欣试验(Optochin试验）
原理：几乎所有肺炎链球菌对奥普托欣试验敏感，而奥普托欣试验对其他链球菌则无抑制作用
培养基：血琼脂平板
方法：将待检菌菌落或肉汤培养液均匀涂布与学琼脂平板上，稍干后贴上含5μg/片的Optochin纸片，35oC培养18-24h观察结果。
结果：抑菌环直径>14mm为敏感，若抑菌环直径≤14mm，对此菌株应在做胆汁溶菌试验，以证实是否为肺炎链球菌。
运用：主要用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别
6、复合生化试验
（1）KIA试验（克氏双糖铁琼脂培养基）
原理：KIA琼脂中含有乳糖浓度是葡萄糖的10倍，分解糖可产酸，使酚红指示剂变色；硫代硫酸钠可供给细菌产生硫化氢所需要的硫，铁盐可与硫化氢反应，生成黑色沉淀。
培养基：克氏双糖铁琼脂培养基
方法：将可疑菌落穿刺和斜面划线接种，35oC培养18-24h观察结果
结果：碱性（K）,酸性（A）
k/k:不发酵碳水化合物，为不发酵菌特征
K/A：葡萄糖发酵，乳糖不发酵，如志贺菌
K/A（黑色）：葡萄糖发酵，乳糖不发酵并产生硫化氢，如沙门菌。
A/A：葡萄糖和乳糖发酵【我这个地方只能确定一定发酵乳糖，加入这个时候葡萄糖不发酵也应该会出现A/A现象的啊？？？】，如大肠埃希菌和克雷伯菌属。
如下图：
运用：主要用于革兰阴性杆菌，尤其是肠杆菌科细菌的鉴定。
（2）MIU试验（动力靛基质尿色酶试验）
原理：将半固体观察动力、靛基质实验和尿素酶实验综合到一起。
培养基：MIU培养基
方法：将可疑菌穿刺接种到MIU培养基内，35oC培养18-24h观察结果。
结果：
动力阳性：可见接种线变宽、变模糊、培养基变浑浊；
靛基质阳性：加入靛基质试剂的界面形成玫瑰红；
尿素酶实验阳性：培养基全部变成红色。
运用：常用于肠杆菌科细菌的鉴定。
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